Сравнительная характеристика методов выделения ДНК из различных объектов биологического происхождения при проведении генотипоскопической экспертизы

(Аникеев О. Е., Степущенко Ю. Г., Газетдинов Н. И., Кравцова О. А.) ("Российский следователь", 2013, N 1) Текст документа

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ОБЪЕКТОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ГЕНОТИПОСКОПИЧЕСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЫ <*>

О. Е. АНИКЕЕВ, Ю. Г. СТЕПУЩЕНКО, Н. И. ГАЗЕТДИНОВ, О. А. КРАВЦОВА

-------------------------------- <*> Anikeev O. E., Stepushchenko J. G., Gazetdinov N. I., Kravtsovа O. A. The comparative characteristic of methods of allocation of DNA from various objects of a biological origin when carrying out examination on human biology.

Аникеев Олег Евгеньевич, Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Степущенко Юлия Геннадьевна, Экспертно-криминалистический центр МВД РФ по Республике Татарстан, г. Казань.

Газетдинов Наиль Исламович, Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Кравцова Ольга Александровна, Казанский (Приволжский) федеральный университет.

Авторы статьи проводят сравнительную характеристику различных методов выделения ДНК и анализируют результаты генотипоскопической экспертизы.

Ключевые слова: ДНК, судебно-биологическая экспертиза, реагент.

Authors of article carry out the comparative characteristic of various methods of allocation of DNA and analyze results of examination on human biology.

Key words: DNA, judicial and biological examination, reagent.

Введение. В последние годы при производстве судебно-биологических экспертиз активно применяется метод ДНК-анализа, основанный на изучении полиморфных локусов ДНК. Использование этого метода в экспертной практике быстро подтвердило его высокую эффективность в получении результатов, способствующих раскрытию и расследованию тяжких и особо тяжких преступлений, для идентификации биологических образцов индивидов. Несмотря на упрощение схемы анализа путем автоматизации процесса амплификации и регистрации получаемых результатов [4, 5], актуальной проблемой при проведении генетического анализа остается получение высококачественной ДНК-матрицы, особенно при исследовании образцов биологического происхождения, подвергшихся процессам деградации (гнилостные изменения, термические и химические воздействия) [1, 2, 6]. Согласно рекомендациям, предлагаемым экспертам-биологам Экспертно-криминалистическим центром МВД России, выделение ДНК в криминалистических лабораториях проводится ограниченным числом методов, таких как препарат хелатирующего реагента Chelex 100 (Promega, Ready Amp Genomic DNA Purification System, США) [9], коммерческий набор DNA IQ System (Promega, США) [11], выделение ДНК с использованием протеиназы К и последующей фенол/хлороформной очисткой, которые имеют ряд ограничений, или их использование не всегда является целесообразным, например, применение магнитных микрочастиц DNA IQ System при выделении ДНК из трупной крови [3, 7, 8]. В связи с этим, в данной работе проведен сравнительный анализ методов выделения ДНК из биологических объектов различной степени деградации с целью дальнейшей разработки рекомендаций по выделению ДНК, а также по организации работы с биологическим материалом в экспертных лабораториях ДНК-анализа. Материалы и методы. В работе проанализировано 10 объектов-носителей ДНК (табл. 1), наиболее часто встречающихся в экспертной практике. Все эксперименты по выделению ДНК проводились в 3-х повторностях.

Таблица 1. Характеристика объектов - носителей ДНК

Объект Предмет-носитель Размер

Кровь Марля (до 2-х недель) 0,5 x 0,5 см

Трупная Бумага (6 - 12 месяцев) 0,5 x 0,5 см кровь

Волосы Шапка (до 1-го месяца) 15 шт.

Слюна Буккальный соскоб (до 1-й недели) 0,5 x 0,5 см

Слюна Окурок сигареты (до 1-й недели) 0,5 x 0,5 см

Сперма Содержимое презерватива (12 - 24 0,5 x 0,5 см месяца)

Потожировые Рукоятка ножа (после обработки 3,0 x 3,0 см отпечатки дактопорошком) (до 1-го месяца)

Перхоть Шапка, следы перенесены на скотч (до 3,0 x 3,0 см 1-го месяца)

Мышечная 3 - 6 месяцев 5 г ткань

Костная 6 - 12 месяцев, гнилостные 5 г ткань изменения

Для выделения ДНК из объектов использовали коммерческие наборы Chelex-100 TM Resin (Bio-Rad, США) [9], DNA IQ System (Promega, США) [10], QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Sciences, США) [11], PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США) [12] (выделение ДНК проводили согласно инструкциифирм-производителей), а также метод фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы K с некоторыми модификациями.

Оценку количества выделенной ДНК проводили методом ПЦР в реальном времени (Rt-PCR) с использованием коммерческого набора Quantifiler латинская буква "R" в окружности Human DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США) на приборе 7500 Real-Time PCR System (фирмы Applied Biosystems, США). Параллельно с этим использовался спектрофотометрический метод (СФ) определения качества и количества выделенных препаратов ДНК. Измерение проводилось на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., США), качество выделенной ДНК оценивали по отношению оптической плотности при длинах волн 260 и 280. Эффективность применения использованных методов выделения ДНК оценивали с помощью последующей амплификации аутосомных STR локусов с использованием мультиплексной системы GenePrint PowerPlex 16 System (Promega, США) [10]. Для этого вычисляли процент успешной амплификации, определяемый как соотношение количества локусов, для которых получен устойчивый, воспроизводимый профиль, к общему числу исследованных маркеров. Результаты и обсуждение. В ходе нашего исследования показано, что эффективность экстракции ДНК отличается в зависимости от того, какой объект биологического происхождения используется для выделения генетического материала: из 10 исследованных объектов - носителей ДНК только для половины образцов (кровь на марле (от живого лица), слюна (эпителиальный соскоб), сперма (содержимое презерватива), перхоть (перенесенная на липкую ленту), потожировые отпечатки) показана примерно одинаковая эффективность использованных наборов для выделения ДНК, при этом вне зависимости от выбранного метода экстракции нами получена 100% воспроизводимость результатов генотипирования. В то же время показано, что среди использованных наборов наибольшей эффективностью обладают методы выделения ДНК на основе наборов DNA IQ System (Promega, США) и PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США), которые являются наиболее оптимальными при работе со следами биологического происхождения, обнаруженных на различных предметах-носителях, в том числе и содержащих ингибиторы ПЦР. Основным преимуществом данных наборов является то, что они просты в использовании, при этом позволяют получить высокомолекулярный, чистый препарат ДНК (табл. 2).

Таблица 2. Концентрация препаратов ДНК, выделенных различными методами

Биологический Методы выделения ДНК объект ФХЭ Chelex 100 DNA IQ System QIAamp Prepfiler DNA Mini Kit

Концентрация ДНК (нг/мкл)

кровь на 0,185 0,217 2,245 12,167 12,930 марле

волосы 0,000 0,017 0,019 0,064 0,089

мышцы ингибирование ингибирование ингибирование 11,892 4,663

кость ингибирование не выделяли не выделяли 0,004 0,170

слюна с кл. 0,457 2,049 35,583 10,181 13,350 эпит. на ватной палочке

слюна с кл. 0,248 0,283 0,957 1,801 0,486 эпит. на окурке сигареты

сперма на 0,308 0,158 5,227 1,720 2,228 марле с сод. презерватива

пот с кл. ингибирование ингибирование 0,053 0,157 0,118 эпит. с рукоятки ножа

перхоть на 0,000 0,000 1,523 2,145 0,417 шапке, перенесенная на скотч

Однако при исследовании профиля аутосомных STR локусов, полученных с ДНК-матрицы объектов, подвергшихся процессам выраженной деградации или содержащих незначительное количество генетического материала, выбор метода экстракции ДНК оказался критическим (табл. 3).

Таблица 3. Эффективность амплификации ДНК из деградированных образцов (на базе системы "GenePrint PowerPlex 16 System")

Образец Метод выделения % успешной амплификации

Кровь трупная на бумаге ФХЭ 100

Chelex 100 0

DNA IQ System 81

QIAamp DNA Mini Kit 100

PrepFiler Forensic DNA 100 Extraction Kit

Кость ФХЭ 100

PrepFiler Forensic DNA 100 Extraction Kit

Мышцы ФХЭ 100

DNA IQ System 100

QIAamp DNA Mini Kit 100

PrepFiler Forensic DNA 100 Extraction Kit

Пот с рукоятки ножа после ФХЭ 100 обработки дактопорошком, перенесенный на скотч Chelex 100 100

DNA IQ System 68

QIAamp DNA Mini Kit 100

PrepFiler Forensic DNA 100 Extraction Kit

Волосы с шапки Chelex 100 0

DNA IQ System 100

QIAamp DNA Mini Kit 100

PrepFiler Forensic DNA 0 Extraction Kit

Учитывая полученные результаты амплификации по пяти исследуемым объектам, выделенными разными методами, можно утверждать, что из 15 аутосомных STR успешно амплифицировались все локусы, полученные на матрице ДНК, выделенной с помощью метода фенолхлорофомной экстракции (трупная кровь, мышечная и костная ткань, а также потожировые отпечатки) и с использованием набора PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США). Заключение. Для получения ДНК высокого качества наиболее предпочтительными методами выделения из мышечной и костной тканей, а также объектов, содержащих трупную кровь, являются фенолхлороформная экстракция и система PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США), для выделения ДНК из волос, потожировых отпечатков, в том числе и после обработки дактопорошком, рекомендуются системы Qiagen DNA Mini Kit (QIAGEN США) и DNA IQ System (Promega, США). Метод выделения ДНК с помощью ионообменной смолы Chelex-100 (Bio-Rad, США) позволяет получать хороший выход ДНК из незагрязненных биологических следов (эпителиальные клетки (например, слюна)).

Литература

1. Иванов П. Л. Индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе // Вестник Российской академии наук. 2003. Т. 73. N 12. С. 1085 - 1097. 2. Левченко Е. В. Следы человека биологического происхождения как объект криминалистического исследования: Дис. ... канд. юрид. наук. 2007. С. 21 - 23. 3. Перепечина И. О. ДНК-анализ в криминалистических исследованиях органов внутренних дел России / НЦБ Интерпола в РФ: информационный сборник. 2003. N 19. С. 58 - 60. 4. Пименов М. Г. Особенности формирования базы данных о генетических признаках на основе автоматизированных информационных систем // Экспертная практика. 2006. N 40. С. 3 - 5. 5. Стороженко И. В. Исследование ДНК тканей и выделений человека на автоматизированных системах: Учебное пособие. М., 2011. С. 6 - 10. 6. Alaeddini R. Forensic implications of PCR inhibition // Forensic Sci. Int. Genet. 2011. V. 6. P. 297 - 305. 7. Maribel E. F. A comparison of the effects of PCR inhibition in quantitative PCR inhibition and forensic STR analysis // Electrophoresis. 2011. V. 32. P. 1084 - 1089. 8. Opel K. L. A study of PCR inhibition mechanisms using Real Time PCR // Forensic sciences. 2009. V. 55. P. 25 - 33. 9. Singer-Sam J. Use of Chelex to improve signal from small number of cells // Amplifications: a forum for PCR Users. 2004. N 3. P. 11. 10. Stepanov V. A. Characteristics of populations of the Russian Federation over the panel of fifteen loci Used for DNA identification and in forensic medical examination // Acta Naturae. 2011. N 3. P. 56 - 67. 11. Technical Bulletin Tissue and Hair Extraction Kit (for use with DNA IQ): protocol. Part 2. TB307 (Revised 5/06). Promega Corporation. Madison, WI, 2006.

TM 12. Testing the Effectiveness of the PrepFiler Kit for DNA Extraction from Forensic Samples (An Overview of Test Site Data). Applied Biosystems. Forensic News, 2008.

------------------------------------------------------------------

Название документа